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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12544 (2023) Citar este artículo
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El presente estudio investigó la expresión de microARN (miR) -199b-3p en el osteosarcoma (OS) y tuvo como objetivo identificar su posible mecanismo de acción que contribuye al desarrollo de esta enfermedad. En primer lugar, se evaluaron los datos de expresión de miR-199b-3p y el dominio en espiral que contiene 88A (CCDC88A) a partir del análisis interactivo de perfiles de expresión genética y se utilizó el trazador Kaplan Meier para evaluar los datos de supervivencia. Al analizar el conjunto de datos GSE65071 del ómnibus de expresión genética, se descubrió que miR-199b-3p se expresaba en un nivel bajo. Mediante el uso de análisis de PCR cuantitativo con transcripción inversa en células y tejidos de OS, se descubrió que CCDC88A se expresaba en un nivel alto. Además, TargetScan predijo que CCDC88A sería un objetivo posterior de miR-199b-3p. Se utilizaron ensayos de indicador de luciferasa para verificar esta predicción. La sobreexpresión in vitro de miR-199b-3p disminuyó la actividad invasiva y proliferativa de las células OS. Los estudios mecanicistas indicaron que la disminución de miR-199b-3p resultó en una mayor expresión de CCDC88A. Al mismo tiempo, impidió la vía Wnt/beta-catenina y el proceso de transición epitelial a mesenquimal. En general, los resultados del presente estudio enfatizaron el papel fundamental del miR-199b-3p en la formación y progresión de la OS, lo que sugiere que podría usarse como un posible biomarcador tumoral.
El osteosarcoma (OS) es una enfermedad que afecta con mayor frecuencia a niños y adolescentes. Se considera uno de los sarcomas óseos maliciosos primarios más universales y con mal pronóstico1. La resección quirúrgica de todos los sitios tumorales, la radioterapia y la quimioterapia son las tres terapias principales utilizadas para el tratamiento de pacientes con OS2. A pesar de los importantes esfuerzos realizados en el tratamiento de la OS, la tasa de supervivencia a 5 años se mantiene entre el 50 y el 80% y las tasas de supervivencia permanecen sin cambios desde 19803,4. Por lo tanto, para aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes e inhibir la progresión de la OS, se requiere urgentemente la identificación de nuevos objetivos terapéuticos y sus mecanismos moleculares.
Los microARN (miR) son un tipo de ARN pequeños no codificantes con una longitud aproximada de 21 a 23 nucleótidos. Se ha informado que ciertos miR contribuyen a la progresión de la OS y pueden usarse en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de esta enfermedad5,6,7. Algunos estudios también han encontrado que miR afecta la metástasis y la invasión del osteosarcoma8. Por ejemplo, la regulación negativa de miR-34a puede activar la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) y promover la metástasis del osteosarcoma9. LINC00210 moduló la radiosensibilidad de las células de osteosarcoma a través del eje miR-342-3p/GFRA1, lo que convirtió a LINC00210 en un objetivo novedoso para mejorar la eficiencia de la radioterapia en el osteosarcoma10. La expresión aumentada de miR-664a podría tener un efecto inhibidor sobre la expresión del gen MEG3 y la migración de células de osteosarcoma11. MiR-659-3p inhibió la progresión del tumor de osteosarcoma y la metástasis pulmonar al inhibir la expresión de SRPK1 y potencialmente la proliferación celular en sentido descendente, y los genes de transición epitelial a mesenquimal12. La alta expresión de miR-183 puede inhibir la vía Wnt/beta-catenina e inhibir la metástasis del osteosarcoma13. Estudios de investigación anteriores han encontrado que miR-199b-3p puede afectar la proliferación, diferenciación y apoptosis en una variedad de tumores14,15. Sin embargo, no se había informado previamente sobre el papel de miR-199b-3p en la OS.
El dominio en espiral que contiene 88A (CCDC88A) puede unirse al citoesqueleto de actina. Akt es una serina/treonina quinasa, necesaria para la migración celular direccional, que en última instancia conduce a la invasión y metástasis en las células cancerosas16. Varios informes han sugerido que CCDC88A está involucrado en la progresión tumoral. La eliminación de la expresión de CCDC88A suprime la migración e invasión de células cancerosas de páncreas, piel y mama humanas, e inhibe significativamente la tumorigénesis primaria in vivo17,18,19, lo que sugiere que CCDC88A tiene un papel clave en el desarrollo del cáncer.
En el presente estudio, mostramos por primera vez que miR-199b-3p tenía una función supresora de tumores en OS al suprimir el crecimiento, la migración y la invasión de las células OS. Luego, caracterizamos a CCDC88A como un objetivo directo de miR-199b-3p. MiR-199b-3p interactuó con la 3'UTR de CCDC88A para inhibir la vía de señalización EMT y Wnt/beta-catenina para mediar su efecto supresor de tumores en la proliferación e invasión de células OS. Estos hallazgos pueden ser útiles para el desarrollo de posibles enfoques clínicos para el tratamiento de la OS.
La supervivencia general de los pacientes con OS y diferentes niveles de expresión de miR-199b-3p se analizó mediante el trazador Kaplan Meier (//kmplot.com/analysis/). Los datos de expresión de CCDC88A y la información de pronóstico se obtuvieron mediante la base de datos de análisis interactivo de perfiles de expresión genética (GEPIA) (//gepia.cancer-pku.cn). Se utilizó GSE65071 para adquirir los datos de expresión de miR-199b-3p de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). La posible asociación entre miR-199b-3p y CCDC88A se obtuvo de TargetScan (http://www.targetscan.org/vert 80/).
Se incluyeron un total de 49 pacientes, que fueron sometidos a tratamiento quirúrgico desde 2010 a 2020 en nuestro hospital. Se obtuvieron un total de 49 pares de OS primarios y tejidos óseos no cancerosos adyacentes. Todos los tejidos se recogieron y se criopreservaron inmediatamente a -80 °C durante la operación. Para confirmar el diagnóstico de OS se utilizaron los criterios histológicos de la Organización Mundial de la Salud y el sistema de estadificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC). Se recomendó el sistema de estadificación del AJCC para la evaluación del pronóstico y la supervivencia de los pacientes con OS20.
Los criterios de inclusión fueron los siguientes: pacientes con osteosarcoma con una supervivencia esperada superior a 3 meses sin radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (i) pacientes con osteosarcoma que recibieron radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía; y (ii) los pacientes que no cooperaron firmaron el formulario de consentimiento informado.
La propuesta fue revisada y aprobada por el Comité de Ética de nuestro hospital antes de su implementación (octubre de 2020; aprobación n.° 2020119). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los tutores de los pacientes incluidos en el presente estudio.
Todas las líneas celulares, incluidas hFOB, MG63 (RRID: CVCL_0426) y U2OS, se adquirieron en Suzhou Culture Collection. Todas las líneas celulares fueron autenticadas mediante análisis STR. Para el cultivo celular se utilizó DMEM (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) que contenía FBS al 10 % (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), estreptomicina (100 μg/ml) y penicilina (100 U/ml). Las células se incubaron en una incubadora humidificada que contenía 5% de CO2 a 37 °C.
Se utilizó TRIzol (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) para extraer el ARN total de células y tejidos de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por los kits. Se utilizaron β-actina y U6 como controles de referencia internos de CCDC88A y miR-199b-3p, respectivamente. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Los imitadores de miR-199b-3p, el inhibidor de miR-199b-3p, el ARNip dirigido a CCDC88A y sus correspondientes grupos de control se adquirieron de Shanghai Genepharma Inc. El método de transfección de ARNip se realizó como se describió anteriormente21. Las secuencias utilizadas se enumeran en la Tabla 2. Cada experimento se realizó por triplicado.
Después de la transfección, se sembraron células U2OS y MG63 a una densidad de 1000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se utilizaron un total de 5 pocillos como réplicas. Se incubó un total de 10 µl de reactivo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (5 mg/ml) con las células (0, 24, 48 y 72 h). grupos) a 37 °C durante 2 h. Posteriormente, se añadieron a los pocillos 150 µl de dimetilsulfóxido. Se utilizó un lector de microplacas para medir la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.
La cámara Transwell se utilizó para investigar la capacidad migratoria de las células OS. Se sembró un total de 200 µl de suspensión celular solo con DMEM en la cámara superior y se agregaron 500 µl de DMEM que contenía 20% de FBS a la cámara inferior. Posteriormente, las células se incubaron durante 48 h y las células que no penetraron a través de la superficie de la membrana se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células restantes se enjuagaron con PBS y se usó paraformaldehído para fijar las células durante 10 minutos, seguido de tinción con cristal violeta al 0,5%. El número de células que atravesaron la membrana se contó mediante un microscopio invertido. Cada experimento se realizó por triplicado.
Se sembraron células MG63 y U2OS en placas de 24 pocillos. Posteriormente, se transfectaron la región 3' no traducida (UTR) de tipo salvaje (wt) o mutante de CCDC88A, el imitador/inhibidor de miR-199b-3p y el control negativo (NC) a las células antes mencionadas utilizando un kit Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen ; Termo Fisher Scientific, Inc.). Después de la transfección, las células se cultivaron durante 48 h y el lisado celular se recogió para medir la actividad de la luciferasa utilizando un sistema de ensayo de gen indicador de luciferasa dual. Las secuencias imitadoras/inhibidoras y NC utilizadas se enumeran en la Tabla 2. Cada experimento se realizó por triplicado (Información complementaria).
Se usó tampón RIPA (Biosharp Life Sciences) para extraer las proteínas totales de las células MG63 y U2OS y se usó el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Inc.) para realizar la cuantificación de proteínas. La electroforesis se realizó utilizando geles SDS-PAGE al 12% y las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Posteriormente se bloquearon con leche descremada al 5% a temperatura ambiente durante 2 h. Las membranas se cortaron y se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche y con un anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se desarrollaron utilizando reactivos de quimioluminiscencia mejorados (Pierce; Thermo Fisher Scientifc, Inc.). Se utilizó el software ImageJ (versión 1.42; Institutos Nacionales de Salud) para medir los valores de gris. Los anticuerpos utilizados en el presente estudio se muestran en la Tabla 3. Cada experimento se realizó por triplicado.
Los datos fueron analizados por GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.). Para la determinación de las diferencias en los datos cuantitativos se utilizaron las pruebas t de Student no apareadas o pareadas. Las variables categóricas fueron evaluadas mediante las pruebas de χ2 o exacta de Fisher. La importancia pronóstica se determinó mediante análisis de Kaplan-Meier y de rango logarítmico. La curva operativa del receptor (ROC) y el área bajo la curva (AUC) se utilizaron para la predicción de biomarcadores. Se utilizó la correlación de Pearson para evaluar la fuerza de la correlación lineal entre dos variables continuas. Se consideró que P <0,05 indicaba una diferencia significativa.
El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Segundo Hospital Popular de Lianyungang (Lianyungang, China) de acuerdo con las directrices del comité de ética. Y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes anteriores.
Todos los pacientes y/o sus tutores legales firmaron un formulario de consentimiento informado.
La expresión elevada de miR-199b-3p se asoció con la supervivencia general de los pacientes con OS según lo determinado por el trazador de Kaplan-Meier (Fig. 1A). Se descubrió que la expresión relativa de CCDC88A era significativamente mayor en los tejidos del sistema operativo después del análisis de la base de datos pública GEPIA (Fig. 1B); también se demostró que estaba asociado con una supervivencia general deficiente (Fig. 1C). Según GSE65071, los niveles de expresión de miR-199b-3p disminuyeron drásticamente en las muestras de sistema operativo (Fig. 1D). Los miARN expresados diferencialmente se analizaron utilizando un gráfico de volcán entre OS y muestras normales (Fig. 1E). El mapa de calor representa la expresión de miARN diferencial parcial en OS (Fig. 1F).
Los niveles de expresión de miR-199b-3p y CCDC88A se evalúan en OS y se asocian con el pronóstico de la enfermedad según lo determinado mediante análisis bioinformático. (A) Los pacientes con OS y alta expresión de miR-199b-3p mostraron una supervivencia favorable (datos del trazador Kaplan-Meier). (B) La expresión de CCDC88A a nivel de ARNm fue alta en 262 tejidos tumorales y baja en 2 tejidos normales (datos de GEPIA). (C) Los pacientes con OS y alta expresión de CCDC88A mostraron una supervivencia deficiente (datos de GEPIA). (D) Según GSE65071, los niveles de expresión de miR-199b-3p disminuyeron drásticamente en las muestras de sistema operativo. (E) Los miARN expresados diferencialmente se analizaron utilizando un gráfico de volcán entre OS y muestras normales (datos de GSE65071). (F) El mapa de calor representa la expresión de miARN diferencial parcial en OS (datos de GSE65071). *P < 0,05, ***P < 0,001. microARN miR, dominio en espiral CCDC88A que contiene 88A, osteosarcoma OS, análisis interactivo de perfiles de expresión genética GEPIA.
Los niveles de expresión de CCDC88A fueron mayores en tejidos tumorales de muestras clínicas (Fig. 2A), mientras que los de miR-199b-3p fueron menores (Fig. 2B). Los niveles de CCDC88A aumentaron en las células tumorales en comparación con los de la línea celular de osteoblastos normales hFOB1.19 (Fig. 2C). Sin embargo, los niveles de expresión de miR-199b-3p disminuyeron en las líneas celulares OS (Fig. 2D). Se observó una correlación negativa entre las expresiones de CCDC88A y miR-199b-3p en pacientes con OS (P = 0,005, r = − 0,39; Fig. 2E). El mejor valor de corte se obtuvo mediante análisis ROC y se seleccionaron dos grupos, según los niveles de expresión de miR-199b-3p (P = 0,004, AUC = 0,67; Fig. 2F). Posteriormente se obtuvo el grupo de alta expresión (n = 15) y el grupo de baja expresión (n = 34) (Tabla 4). Se encontró que el tamaño del tumor, la metástasis a distancia y el estadio clínico se asociaban significativamente con niveles bajos de expresión de miR-199b-3p (P = 0,015, P = 0,047 y P = 0,029, respectivamente). Los niveles bajos de expresión de miR-199b-3p se asociaron con un mal pronóstico en pacientes con OS (P = 0,024) (Fig. 2G).
Determinación de los niveles de expresión de miR-199b-3p y CCDC88A en OS y asociación con el pronóstico de la enfermedad. (A) Los niveles de expresión de CCDC88A en las muestras de OS fueron más altos que los de las muestras normales, según lo determinado mediante análisis RT-qPCR. (B) Los niveles de expresión de miR-199b-3p en las muestras de OS fueron más bajos que los de las muestras normales, según lo detectado mediante análisis RT-qPCR. (C) Los niveles de expresión de ARNm de CCDC88A fueron mayores en las líneas celulares de OS en comparación con los observados en las células de osteoblastos humanos, según lo determinado mediante análisis RT-qPCR. (D) Los niveles de expresión de miR-199b-3p fueron más bajos en las líneas celulares de OS en comparación con los observados en las células de osteoblastos humanos, según lo determinado mediante análisis RT-qPCR. (E) Correlación negativa entre las expresiones miR-199b-3p y CCDC88A. (F) El valor de corte de miR-199b-3p se evaluó en pacientes con OS. (G) Determinación de las curvas de supervivencia para pacientes con OS con respecto a la expresión de miR-199b-3p. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. MicroARN miR, dominio en espiral CCDC88A que contiene 88A, osteosarcoma OS, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa RT-qPCR, área AUC bajo la curva. Cada experimento se realizó por triplicado.
Se transfectó un imitador o inhibidor de miR-199b-3p a células MG63 y U2OS para inducir una regulación positiva o negativa de la expresión de miR-199b-3p. Se utilizó RT-qPCR para detectar la eficiencia del proceso de transfección (Fig. 3A, B). Los resultados de los ensayos MTT indicaron que la proliferación de las líneas celulares OS disminuyó significativamente después de la transfección de las células con imitadores de miR-199b-3p, mientras que la de las líneas celulares OS se promovió después de la transfección de las células con miR-199b- Inhibidores de 3p (Fig. 3C, D). Los ensayos de Transwell indicaron que los niveles de actividad migratoria de las líneas celulares OS disminuyeron significativamente después de la transfección de las células con imitadores de miR-199b-3p, mientras que la transfección de las células con los inhibidores de miR-199b-3p promovió la actividad migratoria de las células OS ( Figura 3E).
miR-199b-3p suprime la proliferación e invasión de células OS. (A) Los niveles de expresión de miR-199b-3p se midieron mediante RT-qPCR en células MG63 transfectadas con imitadores de miR y un inhibidor de miR. (B) Los niveles de expresión de miR-199b-3p se midieron mediante RT-qPCR en células U2OS transfectadas con imitadores de miR y un inhibidor de miR. (C) El análisis de MTT indicó la actividad proliferativa de las células MG63 transfectadas con imitadores de miR-199b-3p y un inhibidor de miR. (D) El análisis de MTT indicó la actividad proliferativa de las células U2OS después de la transfección con imitadores de miR-199b-3p y un inhibidor de miR. (E) La actividad de migración se midió tras el aumento y la disminución de los niveles de expresión de miR-199b-3p en células MG63 y U2OS. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. Osteosarcoma OS, microARN miR, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa RT-qPCR, bromuro de MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, densidad óptica OD. Cada experimento se realizó por triplicado.
Experimentos anteriores revelaron que CCDC88A 3′UTR y miR-199b-3p tenían un sitio de unión putativo según lo determinado por la base de datos TargetScan (Fig. 4A). El ensayo del gen indicador de luciferasa demostró en el grupo CCDC88A-wt que la actividad de luciferasa fue inhibida significativamente por imitadores de miR-199b-3p (Fig. 4B, C), mientras que en el grupo CCDC88A-wt, la actividad de luciferasa fue promovida por miR-199b. Inhibición de -3p (Fig. 4D, E). Posteriormente, se midieron los niveles de CCDC88A mediante RT-qPCR para determinar si miR-199b-3p podría alterar la expresión de CCDC88A. Además, los niveles de expresión de CCDC88A disminuyeron en el grupo de imitadores de miR-199b-3p y aumentaron en el grupo de inhibidor de miR-199b-3p en comparación con los del grupo NC (Fig. 4F, G). Por lo tanto, se concluyó que miR-199b-3p tenía una influencia significativa en la OS al apuntar a CCDC88A.
miR-199b-3p regula negativamente los niveles de expresión de CCDC88A mediante la unión directa a su 3′UTR. (A) El sitio objetivo común de miR-199b-3p y CCDC88A 3′UTR. (B – E) Ensayos del gen indicador de luciferasa. (F) Determinación de los niveles de expresión de CCDC88A en células MG63 después de la transfección con imitadores/inhibidores de miR-199b-3p. (G) Determinación de los niveles de expresión de CCDC88A en células U2OS después de la transfección con imitadores/inhibidores de miR-199b-3p. (H) Los niveles de expresión de ARNm de CCDC88A se evaluaron en células MG63 cotransfectadas con ARNip de CCDC88A mediante RT-qPCR. (I) Los niveles de expresión de ARNm de CCDC88A en células U2OS cotransfectadas con ARNip de CCDC88A se detectaron mediante RT-qPCR. (J) Los niveles de ARNm de CCDC88A en células MG63 cotransfectadas con ARNip de CCDC88A y el inhibidor de miR-199b-3p se detectaron mediante RT-qPCR. (K) Los niveles de ARNm de CCDC88A en células U2OS cotransfectadas con ARNip de CCDC88A y el inhibidor de miR-199b-3p se detectaron mediante RT-qPCR. (L) La actividad proliferativa de las células MG63 cotransfectadas con ARNip CCDC88A y el inhibidor miR-199b-3p se detectó mediante el ensayo MTT. (M) La actividad proliferativa de las células U2OS cotransfectadas con ARNip CCDC88A y el inhibidor miR-199b-3p se detectó mediante el ensayo MTT. (N) La actividad invasiva de las células MG63 y U2OS cotransfectadas con ARNip CCDC88A y el inhibidor miR-199b-3p se determinó mediante el ensayo Transwell. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. microARN miR, dominio en espiral CCDC88A que contiene 88A, región no traducida UTR, ARN de interferencia pequeño de ARNip, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa RT-qPCR, MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- bromuro de difeniltetrazolio, eliminación de KD, control negativo NC, densidad óptica OD, tipo salvaje, mutante mut, ns no significativo, secuencia codificante CDS. Cada experimento se realizó por triplicado.
La eficiencia de eliminación de CCDC88A se exploró mediante análisis RT-qPCR (Fig. 4H, I). Se encontró que la expresión de CCDC88A aumentó después de la transfección con inhibidores de miR-199b-3p en células MG63 y U2OS en comparación con las del grupo de control; sin embargo, aumentó inversamente cuando se cotransfectó con inhibidores de miR-199b-3p (Fig. 4J, K). Los resultados de los ensayos de MTT revelaron que la proliferación de células OS podría revertirse mediante la eliminación de la expresión de CCDC88A (Fig. 4L, M). Los resultados del ensayo Transwell indicaron que la invasión de las células OS podría revertirse mediante la eliminación de la expresión de CCDC88A (Fig. 4N).
Los niveles de proteína de β-catenina, E-cadherina, c-myc, ciclina D1, vimentina y N-cadherina se detectaron en células OS que sobreexpresaban miR-199b-3p. Se demostró que cuando se suprimió la expresión de miR-199b-3p en células OS, los niveles de expresión de todas las proteínas clave antes mencionadas aumentaron excepto la E-cadherina (Fig. 5A). En conjunto, los resultados indicaron que CCDC88A regulado por miR-199b-3p indujo la proliferación e invasión de tumores en OS a través de las vías de señalización EMT y Wnt/beta-catenina (Fig. 5B).
El eje miR-199b-3p/CCDC88A regula los comportamientos malignos de las células OS a través de la vía Wnt/β-catenina y el proceso EMT in vitro. (A) La inhibición de la expresión de miR-199b-3p activa la vía de señalización Wnt/β-catenina y el proceso de transición epitelial-mesenquimal. (B) El eje miR-199b-3p/CCDC88A regula el comportamiento maligno de las células OS a través de la vía Wnt/β-catenina y el proceso EMT. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. MicroARN miR, dominio en espiral CCDC88A que contiene 88A, osteosarcoma OS, transición epitelial a mesenquimatosa de EMT, región no traducida de UTR, transición epitelial-mesenquimatosa de EMT. Cada experimento se realizó por triplicado. Nota: durante el desarrollo de los miembros de transferencia Western, debido a la exposición y al ajuste de contraste, los bordes de algunos miembros no se mostraban claramente en las imágenes.
Como nuevo regulador, miR-199b-3p tiene particular relevancia para la tumorigénesis en una amplia gama de tumores14,15. Además, la sobreexpresión de miR-199b-3p obstaculizó la proliferación de células de cáncer colorrectal e indujo su apoptosis al disminuir la neurona motora 1 rica en cisteína (CRIM1) a través de la vía Wnt/beta-catenina15. En el cáncer de próstata, se ha informado que miR-199b-3p puede atacar la fosfolipasa c épsilon y, en consecuencia, suprimir la proliferación maligna8. También se demostró que una menor expresión de miR-199b-3p se correlacionaba con un mal pronóstico de los pacientes con cáncer de próstata14.
En el presente estudio, se analizó GSE65071 a partir de la base de datos GEO y los datos demostraron que los niveles de expresión de miR-199b-3p estaban regulados negativamente en OS. Este hallazgo se verificó posteriormente en líneas celulares de OS. En los 49 casos con OS, los niveles de expresión de miR-199b-3p también fueron significativamente más bajos en los tejidos cancerosos en comparación con los observados en los tejidos paracancerosos. Según los datos del tejido del paciente, se utilizó el análisis de la curva ROC para obtener el valor del AUC, que se estimó en 0,67, lo que indica que miR-199b-3p era un predictor diagnóstico sensible de la SG. Para investigar las funciones biológicas de miR-199b-3p, se implementaron ensayos MTT y Transwell. Se reveló que la proliferación y la invasión se inhibieron tras la regulación positiva de miR-199b-3p en las líneas celulares MG63 y U2OS. Según el análisis de Kaplan-Meier, una menor expresión de miR-199b-3p se asoció con un tiempo de supervivencia general más corto. Estudios anteriores han demostrado que miR-199b-3p ejerce su función como supresor de tumores en el cáncer de próstata, carcinoma colorrectal y cáncer de vejiga, mientras que actúa como oncogén en el cáncer de páncreas14,15,22. Con base en esta evidencia, el presente estudio investigó el objetivo potencial de miR-199b-3p en OS.
En el presente estudio, TargetScan descubrió que miR-199b-3p posee un sitio de unión potencial con CCDC88A. Se ha informado que CCDC88A desempeña un papel importante en la progresión tumoral y también se ha confirmado que funciona como un oncogén en tumores23. De estos estudios se deduce que CCDC88A está implicado en la progresión tumoral de varios tipos de cáncer, como el de mama, colon y cuello uterino24,25,26. También se ha informado que CCDC88A participa en la formación del citoesqueleto de actina y mejora la fosforilación de Akt, y también actúa aguas abajo de la vía de señalización PI3K/Akt y es activado directamente por Akt27. También se ha informado que CCDC88A puede unirse y activar Gαi3, lo que activa aún más la vía de señalización PI3K/Akt28. Un investigador sobre glioblastoma también ha confirmado que la expresión de CCDC88A está estrechamente relacionada con la malignidad del tumor, incluido el grado histológico y la metástasis, así como con la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global29. En el cáncer colorrectal humano, CCDC88A se asoció con el estadio tumoral TNM y las tasas de metástasis hepática y otras metástasis a distancia30. Sin embargo, el efecto de CCDC88A sobre la progresión de la OS y su mecanismo regulador aún no está claro. Hasta la fecha, CCDC88A no se ha estudiado en OS. En nuestro estudio, se encontró que la expresión relativa de CCDC88A era significativamente mayor en los tejidos del sistema operativo y también se demostró que estaba asociada con una supervivencia general deficiente. El vínculo entre CCDC88A y miR-199b-3p fue atestiguado mediante ensayos de indicador de luciferasa en el presente estudio. Más importante aún, se observó que los niveles de expresión de CCDC88A disminuyeron en líneas celulares OS con niveles de miR-199b-3p regulados positivamente. Esto demostró que miR-199b-3p y CCDC88A tenían una asociación negativa, lo que concordaba con los hallazgos en las muestras clínicas. Sorprendentemente, se descubrió que CCDC88A podría revertir parcialmente el efecto inhibidor causado por la inducción de miR-199b-3p. El presente estudio demostró que miR-199b-3p podría unirse a CCDC88A y revertir su efecto inhibidor sobre la proliferación e invasión de las líneas celulares del sistema operativo.
Posteriormente, también se investigó el mecanismo molecular de la regulación de la agresividad del sistema operativo por el eje miR-199b-3p/CCDC88A. Se ha informado que miR-199b-3p puede modular la proliferación y la invasión en el cáncer colorrectal a través de la vía de señalización Wnt/beta-catenina dirigiéndose a CRIM115. También se ha demostrado que la vía Wnt/beta-catenina puede facilitar la proliferación y diferenciación de células cancerosas, que desempeñan un papel fundamental en la tumorigénesis31. En el presente estudio, los datos indicaron que miR-199b-3p puede inhibir la proliferación de células OS a través de la vía Wnt/β-catenina. Estos hallazgos son consistentes con los resultados informados en un estudio anterior. La EMT se considera un proceso embrionario debido a la disminución de los complejos de adherencia célula-célula. Dota a las células de propiedades migratorias e invasivas mejoradas y promueve la metástasis tumoral32. Las células cancerosas pueden exhibir alteraciones de EMT debido a niveles bajos de expresión de E-cadherina y altos niveles de expresión de N-cadherina y vimentina33. En 2021, se informó que miR-199b-3p podría inhibir la EMT y causar disfunción de los túbulos renales en la nefropatía diabética34. En el presente estudio, se descubrió que miR-199b-3p puede afectar la invasión celular mediante EMT en OS.
En general, el presente estudio demostró por primera vez que el eje miR-199b-3p/CCDC88A regulaba el desarrollo del sistema operativo a través del proceso EMT y la vía Wnt/beta-catenina. Sin embargo, el presente estudio contiene ciertas limitaciones. Fue un estudio retrospectivo, que se realizó in vitro, puede no reflejar el comportamiento de OS in vivo; y sólo se incluyeron 49 casos, el tamaño de la muestra fue pequeño y la generalización puede ser limitada. Por lo tanto, futuros estudios deberían abordar estas limitaciones.
En conclusión, los resultados del presente estudio indicaron que el eje miR-199b-3p/CCDC88A podría desempeñar un papel importante en la progresión de la OS al afectar las vías de señalización EMT y Wnt/beta-catenina.
Los conjuntos de datos generados en el presente estudio pueden solicitarse al autor correspondiente.
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Estos autores contribuyeron igualmente: Dongsheng Zhu y Han Qi.
Departamento de Cirugía Pediátrica, Primer Hospital Popular de Lianyungang, 182 Tongguan North Road, Lianyungang, 222000, Jiangsu, República Popular de China
Dongsheng Zhu y Hongqi Zhu
Departamento de Cirugía de Emergencia, Segundo Hospital Popular de Lianyungang, 41 Hailian East Road, Lianyungang, 222000, Jiangsu, República Popular de China
Han Qi
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HQ, DZ y HZ diseñaron los experimentos. DZ realizó los experimentos. HQ recogió las muestras de los pacientes. DZ preparó el manuscrito. DZ y HZ revisaron críticamente el manuscrito en busca de contenido intelectual importante. DZ ayudó con el análisis estadístico. DZ y HZ confirman la autenticidad de todos los datos sin procesar. Todos los autores confirmaron la autenticidad de todos los datos sin procesar y aprobaron la versión final del manuscrito.
Correspondencia a Dongsheng Zhu o Han Qi.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
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Zhu, D., Qi, H. & Zhu, H. hsa-miR-199b-3p suprime la progresión del osteosarcoma al atacar CCDC88A, inhibir la transición epitelial a mesenquimatosa y la vía de señalización Wnt/beta-catenina. Representante científico 13, 12544 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39537-0
Descargar cita
Recibido: 12 de marzo de 2023
Aceptado: 26 de julio de 2023
Publicado: 02 de agosto de 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39537-0
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